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本试剂盒采用经济快速的方法高效制备大肠杆菌感受态细胞，在传统方法的基础上简化了操作步骤，提高了感受态细菌的转化效率。

本试剂盒已被成功地用于从多种大肠杆菌菌株细胞制备感受态细胞，其中包括常用的克隆株（JM109，DH5α，TOP10等）和表达菌株（BL21家族）用于基因克隆、质粒扩增或重组蛋白的表达。

该试剂盒可采用两种方法制备感受态细胞：标准制备法和快速制备法。这两种方法制备感受态细胞比传统CaCl₂法和Hanahan法更加简单快捷，不需要0～4℃孵育和传统的热击处理。采用快速方法制备的感受态细胞pUC 18质粒转化大肠杆菌JM109的转化效率为>1.0×10⁵ cfu/μg；使用标准方法的转化效率为>1.0×10⁶ cfu/μg。

• 感受态制备过程只需一步悬浮。
  
• 适合大/小量快速制备。
  
• 制备好的感受态可直接冻存于-70℃。
  
• 转化过程无需热激步骤。
  
• 标准转化效率为10⁶～10⁸/μg DNA。

组分	40T	200T
BT Buffer T (2X)	4mL	5×4mL
Sterilized ddH2O	4mL	5×4mL
BT Media(50mL)	1个	5个

保存：2～8℃


一、标准感受态细胞制备流程
自备材料：目标菌种、LB培养基及平板、离心机、离心管、冰等。
准备工作：将2×BT Buffer T和无菌蒸馏水等体积混合后置冰上预冷，每ml菌液需要100μL稀释好的BT Buffer T。

• 在平板上挑取单克隆或冻存的甘油菌，接种至2～5mL合适的培养基中，37℃培养过夜。
  
• 将过夜培养的菌液按1:100稀释比例加入到预热的新鲜LB培养基中，250rpm 37℃培养至细菌生长至早对数期（OD600=0.3~0.4）时，时间通常为1.5~3h。
  
• 将上述培养好的菌液于3500～5000rpm，4℃离心5～10min，收集细胞。
  
• 按照每mL培养菌液加入100μL Buffer的比例加入前边准备好的冰上预冷的1×BT buffer T，用吸头充分悬浮细胞，冰上放置10min。可直接用于转化或分装后用液氮冻存，-70℃保存备用。

二、快速感受态细胞制备流程
自备材料：目标菌种、LB培养基、离心机、离心管、冰等。
准备工作：将2×BT Buffer T置冰上预冷。

• 在平板上挑取单克隆或冻存的甘油菌，接种至2～5mL合适的培养基中，37℃培养过夜。
  
• 将过夜培养的菌液按1:100稀释比例加入到预热的新鲜LB培养基中，250rpm 37℃培养至细菌生长至早对数期（OD600=0.3~0.4）时，时间通常为1.5~3h。
  
• 取100μL菌液置冰上预冷10min，取等体积冰上预冷的2×BT Buffer T混合，冰上放置10～30min。可直接用于转化或-70℃冻存。

三、标准转化流程
自备材料：LB培养基、LB平板、合适抗生素、待转化质粒或连接产物等。
准备工作：调节水浴锅至42℃，将活化用的LB或SOC培养基预热至37℃，将含相应抗生素的平板预热至37℃。

• 将从超低温冰箱中取出的感受态细胞置冰上融化。
  
  • 新鲜制备的感受态细胞可以在冰上保存0～48h，直接使用。
• 每管感受态加入100pg～10ng待转化DNA或连接产物，轻柔混匀，于冰上静置30min。
  
  • DNA体积不超过感受态细胞体积的5%。
    
  • 冰上静置时间少于15min将降低转化效率。
    
  • 此处可设置用无菌水代替DNA进行转化的对照组1（见附录）。
• 将离心管置42℃水浴锅中孵育45～90sec，取出后立即冰上放置2～3min。
  
  • 热激时请勿搅动。
• 加入800～900μL预热至37℃的不含抗生素的LB或SOC培养基，颠倒混匀。
  
• 于37℃摇床缓慢振荡培养45～60min。
  
  • 摇床转速不超过220rpm。
• 取适量菌液涂布至与目标质粒抗性相应的LB平板中，于37℃培养箱中倒置培养过夜（12-16h）。
  
  • 此处可将菌液涂布一份至不含抗生素的平板上，作为对照组2（见附录）。
    
  • 分别取不同的菌液量，如1～2μL、10～20μL、100～200μL涂布平板以避免转化子太多导致难以挑斑的情况。
    
  • 如果需要进行蓝白斑筛选，在培养基中加入终浓度为40μg/mL的X-gal和1mmol/L的IPTG。
    
  • 使用平板涂布专用玻璃珠(货号：GS0140)进行涂布可以比传统涂布方法获得更多转化子。

四、快速转化流程（不经过热激的转化步骤）
自备材料：LB培养基、LB平板、合适抗生素、待转化质粒或连接产物等。
准备工作：将含合适抗生素的LB平板预热至37℃。

• 将从超低温冰箱中取出的感受态细胞置冰上融化。
  
• 每管感受态加入100pg～10ng待转化DNA，用枪头轻柔混匀，于冰上静置10min。
  
• 加入1mL预热至37℃不含抗生素的LB或SOC培养基，混匀。于37℃摇床缓慢振荡培养45～60min。
  
  • 对于使用Ampicillin筛选而言，该步骤可以省略，可以直接将感受态和DNA的混合溶液涂布至含有抗生素的平板上。
• 取适量菌液涂布至含有与目标质粒抗性相应的抗生素的LB平板中，37℃培养箱中倒置培养过夜。

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